DNA质检的常用方法及如何看懂DNA质检图，一文了解！

在进行高通量测序之前，核酸质检是非常重要的一步，可以帮助我们确认样品核酸的质量、完整性及浓度等信息，不合格的核酸会影响到建库成功率及测序结果的准确性和可靠性。

因此，进行高通量测序前必须进行核酸质检，以确保实验的成功和有效性。今天，科技君带大家了解一下DNA质检的常用方法及如何看懂DNA质检图。

一般情况下，DNA质检首先会使用Qubit Fluorometer或酶标仪检测浓度。Qubit和Plate reader的原理类似，荧光染料与DNA特异性结合后会发出荧光信号，然后用Qubit Fluorometer收集信号并与标准品进行对比，计算出DNA浓度。常规DNA建库（如全基因组测序或宏基因组建库）所需浓度和总量约为：

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有些老师或同学可能会使用Nanodrop等紫外分光光度计的原理进行定量，但是这些方法容易受到蛋白质，盐离子以及RNA等影响，从而使定量不准。以RNA污染为例，从下图可以看出，随着RNA的比例增加，用UV（紫外分光光度计的原理）检测到的DNA浓度偏高，而Qubit检测的DNA浓度稳定。

比较Qubit检测法与UV分光光度法在测定含有10ng/µL lambda DNA和不同含量（0-100ng/µL）大肠杆菌核糖体RNA的样品中的表现^[1]

在确认好DNA的浓度和总量之后，还会使用琼脂糖凝胶电泳技术进一步的质检，其基本原理是利用琼脂糖凝胶的孔隙性和电泳的作用，将DNA分子按大小分离出来，从而检测DNA的纯度、大小和完整性等信息。在查看DNA电泳胶图时，需要注意以下几点：

1

看目的条带是否明亮清晰

2

看泳道内是否有降解弥散区

3

看胶孔处有无蛋白污染

4

看有无RNA污染

接下来，我们就来看几个图例，帮助大家更好地理解：

还有一些比较特殊的DNA，比如ChIP-seq实验后的DNA或者是cfDNA等微量的样品需要选择灵敏度更高的技术检测，如微流控芯片和毛细管电泳进行检测（Agilent 2100或Caliper）。

以ChIP-seq样品为例：

①为样品名或是样品编号；

②为纵坐标（RFU）：仪器收集到的片段的荧光值；

③为横坐标（Size nt）：各峰的片段大小；

④为峰型显示区以及面积统计区；

⑤为模拟的胶图以及片段情况。

综上所述，在进行DNA样品处理之前，通常需要先自行跑胶检测，以确定样品是否存在蛋白质或RNA等污染物，并评估处理效果。对于需要去除蛋白质污染的样品，可以使用蛋白酶K等酶进行处理；对于存在RNA污染的样品，则可以使用RNase等酶进行处理。具体操作时，可以根据实验需要确定酶的种类和浓度，并将其加入到DNA样品中进行反应。反应结束后，可以通过柱层析或其他方法将处理后的DNA纯化提取出来，以用于下一步的建库和测序。

在进行DNA质量评判时，需要注意DNA的来源和处理过程等因素对样品质量的影响。例如，不同的样品类型和提取方法可能会对DNA的质量产生不同的影响，因此需要根据具体情况进行相应的优化和调整。此外，还需要注意DNA样品的保存和处理条件，避免样品的降解和污染，以保证测序结果的准确性和可靠性。有效的核酸质检可以减少整体实验成本和时间。如果样品的质量不好，进行高通量测序可能会产生大量异常数据，导致实验成本和时间的浪费。

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参考出处：

[1] Thermo Fisher Scientific. 2018. Comparison of Fluorescence and UV-Based Quantitation Methods for dsDNA [Online]. Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/Technical-Notes/fluorescence-UV-quantitation-comparison-tech-note.pdf (Accessed: 11th April 2023).

供稿：Lucy Wang

编辑：市场部

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